バイオプロセスおよび発酵パイロットプラントでは、最適なDoレベルをどのように維持するのか？Otr、Our、酸素需要を理解する

バイオプロセスおよび発酵パイロットプラントでは、酸素移動量を生物学的な酸素取り込み量に継続的に適合させることで、溶存酸素（DO）を維持します。 DOセンサーが培養液中の酸素濃度をリアルタイムで測定し、カスケード制御システムが撹拌、無菌空気流量、ガス組成、反応器圧力、または純酸素の補給を調整します。指数増殖期には、運転目標を通常、空気飽和度の約20%以上に維持しますが、適切な臨界値は微生物、細胞株、製品、プロセスによって異なります。

中心となる制御課題は、酸素移動速度（OTR）を酸素消費速度（OUR）以上に維持することです。増殖中の細胞が、反応器内で気相から液相へ移動できる速度を上回って酸素を消費すると、DOは低下します。そのため、パイロットプラントでは培養が酸素制限に達する前に、混合と酸素供給能力を高めます。

パイロットプラントにおける溶存酸素の制御方法

リアルタイムDO測定

分極式または光学式DOプローブが、液相中の酸素濃度を測定します。コントローラーはこの測定値を、通常は空気飽和度の割合で表される設定DO値と比較します。

設定値は一律ではありません。好気性微生物培養では、増殖速度の制限を避けるためにおおむね20%飽和度以上で運転する場合があります。一方、一部の哺乳類細胞プロセスでは、約30%飽和度、または細胞株固有の別のしきい値が使用されます。

カスケード撹拌制御

最初の制御動作として、インペラー速度を上げることがよくあります。撹拌を強めると気泡が分散し、気液界面積が増加するとともに、液膜抵抗が低下します。

これらの効果により、体積酸素移動係数であるkLaが増加し、酸素が気泡から培養液へより速く移動できるようになります。撹拌は効果的ですが、消費電力が増加し、せん断応力が高まる可能性があります。

通気およびガス組成の制御

撹拌を強めても不十分な場合、スパージャーを通じた無菌空気流量を増加させることができます。リング式およびチューブ式スパージャーは、培養液全体にガスを分散させるために一般的に使用されます。

空気流量を増やすと酸素供給量は増加しますが、発泡、過剰なガスストリッピング、蒸発損失の増大を引き起こす可能性もあります。そのため、空気流量は通常、定められた運転範囲内で調整されます。

酸素富化ガスまたは純酸素

空気と撹拌だけでは十分な移動能力を確保できなくなった場合、コントローラーは入口ガス中の酸素割合を高めることができます。純酸素の補給は、酸素需要が急激に増加する高密度流加培養に特に有効です。

酸素割合を高めると、飽和時の酸素濃度であるC*が上昇するため、液相側の駆動力が増加します。これにより、現実的でないほど高い空気流量や撹拌速度を必要とせずに、DOを安定させることができます。

圧力および反応器設計

反応器の圧力を高めることでも酸素溶解度が上昇し、酸素移動の駆動力を高めることができます。エアリフト発酵槽では、ガスの表面速度、酸素消費率、流路形状、生物学的速度論パラメーターと併せて、圧力の選定を評価する場合があります。

設計計算やシミュレーションによって、反応器の各領域におけるDOプロファイルを推定できます。その後、機械的およびプロセス上の制限内で所望の酸素濃度を達成するため、運転圧力を反復的に調整します。

酸素需要を決定する要因

バイオマス濃度

通常、最も大きな一次要因は、反応器内で活発に呼吸しているバイオマスの量です。細胞密度が増加すると、各細胞の酸素需要が変わらない場合でも、総酸素取り込み速度は一般に増加します。

有用な関係式は次のとおりです。

[ OUR = q_{O_2}X ]

ここで、OURは体積酸素取り込み速度、(q_{O_2})は比酸素消費速度、(X)はバイオマス濃度を表します。

比酸素消費量

比酸素消費速度は、バイオマス単位量あたりの酸素消費速度を示します。これは、増殖速度、基質の利用可能性、温度、pH、溶存酸素、栄養バランス、細胞の生理状態によって変化します。

細胞は、バイオマス合成、エネルギー生成、維持代謝、組換え産物の発現、プラスミド複製、その他の代謝活動のために酸素を消費します。したがって、酸素需要を基質濃度だけから推定することはできません。

増殖速度と代謝状態

指数増殖期には、培養液が高い速度で新たなバイオマスを合成するため、酸素需要が増加することがよくあります。流加培養プロセスでは、追加された基質がより速い増殖を支える場合、供給速度の上昇によって酸素取り込み量がさらに増加する可能性があります。

この関係は必ずしも線形ではありません。酸素制限、炭素オーバーフロー代謝、ストレス、または産物形成によって代謝経路が変化し、酸素消費量と二酸化炭素生成量の両方が変わる可能性があります。

炭素および窒素基質

バイオマス形成では、すべての炭素基質が二酸化炭素と水へ完全酸化されるわけではありません。炭素と窒素の一部は細胞物質に取り込まれ、残りは二酸化炭素、水、有機酸、アルコール、その他の細胞外代謝物になる場合があります。

したがって、必要な酸素量は実際の代謝経路および化学量論的経路に依存します。同じグルコース供給でも、増殖条件や微生物が異なれば酸素需要は異なる可能性があります。

組換え発現とプラスミド維持

組換え微生物では、プラスミドの複製、維持、外来タンパク質の発現に追加の酸素が必要になる場合があります。高い発現負荷はエネルギー要求量を増加させ、培養液の呼吸挙動を変化させる可能性があります。

DOの急激な枯渇や大きな変動は代謝シフトを引き起こす可能性があり、プラスミドを含む培養液ではプラスミドの不安定化につながる場合があります。そのため、安定した自動制御は、バイオマス形成と製品の一貫性の両方にとって重要です。

培養液のレオロジーと細胞密度

バイオマスが蓄積すると、培養液の粘度が上昇する可能性があります。粘度の高い培養液では気泡分散が低下し、物質移動抵抗が増加するため、実効的な酸素移動能力が低下します。

したがって、細胞密度と培養液のレオロジーは、酸素供給に直接的にも間接的にも影響します。低密度時には十分な酸素を移動できる反応器でも、同じバッチの後半には酸素制限に陥る可能性があります。

酸素移動バランス

酸素移動速度

反応器は、細胞による消費量を満たす速度で、気相から液相へ酸素を移動させる必要があります。簡略化した式は次のとおりです。

[ OTR = k_La(C^* - C_L) ]

ここで、(k_La)は酸素移動能力、(C^*)は現在のガスおよび圧力条件における飽和濃度、(C_L)は実際の液相DO濃度を表します。

制御システムは、撹拌と通気によって(kLa)を高めるか、酸素富化と加圧によって(C^*)を高めることで、OTRを増加させることができます。

酸素取り込み速度

OURは酸素に対する生物学的需要を表します。活性バイオマス量、比呼吸活性、増殖または産物形成による代謝負荷の増加に伴って上昇します。

基本的な運転要件は次のとおりです。

[ OTR \geq OUR ]

OURがOTRを上回ると、測定されたDOは臨界値に向かって低下します。この不均衡が続くと、増殖速度、生存率、生産性、または製品品質が低下する可能性があります。

局所的な酸素勾配

バルクDOの測定値が良好であっても、容器全体で酸素が均一に利用できるとは限りません。センサーが許容可能な平均濃度を示している場合でも、混合の悪い領域では酸素制限が生じる可能性があります。

このため、パイロットプラントではDO設定値だけに依存せず、インペラーの位置、スパージャーの設計、混合時間、ガス分配、撹拌能力を評価します。

酸素需要の評価方法

呼吸商

呼吸商（RQ）は、生成した二酸化炭素と消費した酸素のモル比です。

[ RQ = \frac{\text{生成した } CO_2 \text{ のモル数}}{\text{消費した } O_2 \text{ のモル数}} ]

排ガス中の酸素と二酸化炭素を分析することで、代謝状態の変化を把握し、基質過剰、酸素制限、または産物形成の変化によるシフトを特定するのに役立ちます。

RQはプロセスモニタリングの指標であり、直接的なDO測定の代替ではありません。その解釈は、培養液内で活性化している代謝経路に依存します。

化学的酸素要求量と総酸素要求量

化学的酸素要求量（COD）および総酸素要求量（TOD）は、プロセス流体またはサンプル中の物質を酸化するために必要な酸素量を経験的に測定する手段となります。

これらの測定値は、物質収支や廃水処理の評価を支援できますが、生きた培養液の生物学的酸素取り込み速度と直接等しいものではありません。そのため、バイオマス測定、排ガス分析、反応器の酸素移動試験と併用する必要があります。

酸素移動試験

パイロットプラントでは通常、関連する撹拌、空気流量、圧力、温度、培養液粘度の条件下で酸素移動性能を評価します。得られた移動データによって、反応器の実用的な能力が定義されます。

培養液が高密度または高粘度になると酸素移動性能が低下することが多いため、試験には予想される最高バイオマス濃度と供給速度を含める必要があります。

トレードオフの理解

過剰な撹拌

撹拌機の速度を上げることは酸素移動量を増加させる迅速な方法ですが、消費電力が増加し、せん断に敏感な細胞を損傷する可能性があります。また、冷却システムによる除去が必要な熱を発生させる場合もあります。

したがって、可能な限り高い撹拌速度を目標にすることは適切ではありません。目標は、許容可能なせん断、電力、熱的制限の範囲内で十分な酸素移動を確保することです。

過剰な空気流量

高いガス流量は酸素の利用可能性を改善できますが、過剰な泡を発生させ、気液界面での細胞損傷リスクを高める可能性があります。泡制御システムや消泡剤の添加自体が、物質移動や下流工程に影響する場合もあります。

空気流量は無制限の制御変数として扱うのではなく、撹拌およびガス組成と連携させて調整する必要があります。

純酸素の補給

純酸素は、特に高密度培養において大きな酸素移動能力を提供します。ただし、運転コストが増加し、適切なガス取り扱い、制御、安全システムが必要になります。

酸素富化は、安定しない制御や、感受性の高い培養液への過剰な酸素曝露を防ぐ制限値を設けた、明確なカスケード戦略に従って導入する必要があります。

単一のDOしきい値への過度な依存

20%飽和度などのDO目標は有用な運転基準ですが、普遍的な生物学的ルールではありません。臨界酸素濃度は、微生物、細胞株、温度、圧力、培地組成、プロセス目的によって異なります。

他のシステムの設定値をそのまま使用するのではなく、実際の増殖および生産性要件に基づいてプロセスを特性評価する必要があります。

目的に応じた適切な選択

最も信頼性の高い方法は、想定される運転範囲全体で酸素需要を定義し、バイオマスと粘度の増加に伴ってOTR能力を維持できるカスケードを構成することです。

主な目的がバイオマスの最大化である場合：DOを培養液固有の臨界しきい値以上に維持し、増殖のピーク時に酸素制限が生じないよう、撹拌、通気、酸素富化を使用します。
主な目的が組換えタンパク質の生産である場合：プラスミドの維持と発現による追加の呼吸負荷を考慮し、短期的な是正動作よりも安定したDO制御を優先します。
主な目的がスケールアップである場合：培養液のレオロジー、スパージャー設計、圧力、混合の影響を含め、予想されるOURを測定済みの酸素移動能力と適合させます。
主な目的がプロセスモニタリングである場合：DOの推移を、排ガス中の酸素および二酸化炭素の測定値、RQ、バイオマスデータ、基質供給情報と組み合わせます。
主な目的がエネルギーおよび運転コストの削減である場合：OTRを確実にOUR以上に維持できる、最も低い撹拌、空気流量、圧力、酸素富化設定を使用します。

溶存酸素を生物学的需要と反応器の移動能力との動的なバランスとして扱うことで、パイロットプラントは増殖、生産性、プロセスの一貫性を維持できます。

まとめ表：

主要因子	DO制御または酸素需要における役割	実務上の考慮事項
DOセンサーと設定値	培養液中の酸素を測定し、目標濃度を維持する	微生物、細胞株、プロセス目的に応じて臨界DOレベルを設定する
酸素移動速度（OTR）	気相から液相へ酸素を供給する	OTRはOUR以上に維持する必要がある
酸素取り込み速度（OUR）	生物学的な酸素消費量を表す	バイオマス、増殖速度、呼吸活性、産物発現の増加に伴って上昇する
撹拌	気泡分散を改善し、kLaを増加させる	速度を高めると消費電力が増加し、せん断応力が高まる可能性がある
通気およびスパージング	酸素を供給し、気液接触を改善する	過剰な空気流量は発泡、ストリッピング、蒸発を引き起こす可能性がある
酸素富化と圧力	酸素溶解度と移動駆動力を高める	高密度培養に有効だが、コストおよび安全管理が必要
バイオマスと培養液のレオロジー	細胞密度の上昇により需要と粘度が増加する	高密度または高粘度の培養液では酸素移動能力が低下する可能性がある
代謝状態	比酸素消費量と副産物生成を決定する	増殖、基質供給、組換え発現、ストレスをモニタリングする
排ガス分析とRQ	酸素消費と二酸化炭素生成を追跡する	信頼性の高い診断のため、DO、バイオマス、供給、移動試験と組み合わせる
スケールアップ試験	実際のプロセス条件下で酸素移動能力を確認する	最高バイオマス、供給速度、粘度、撹拌、空気流量、圧力を試験する

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