数学的モデルは、粒子の特性と流体条件を粒子が移動すべき半径方向の距離と関連付けることで、遠心分離の設定を決定します。 ストークス領域における球形粒子の場合、沈降時間は以下の通りです。

[ t=\frac{9\mu_c}{2\omega^2R^2(\rho_p-\rho_f)} \ln\left(\frac{r_2}{r_1}\right) ]

ここで、(R) は粒子半径、(\rho_p-\rho_f) は粒子と流体の密度差、(\mu_c) は流体の粘度、(\omega) は角速度、(r_1) および (r_2) は粒子の半径方向の経路を定義します。パイロットプラントにおいて、この関係は、細胞、オルガネラ、またはその他の細胞内産物を回収するために使用されるローター速度、滞留時間、温度、および遠心分離ステップの順序を決定します。

中心となる設計原則は、粒子半径が大きく、密度差が大きく、遠心速度が高いほど沈降は速くなるが、粘度が高いほど遅くなるという点です。 微分遠心分離は、段階的に強い遠心力を加えることで、大きな構造物を先に沈降させ、小さな構造物を後のステップで回収するというこれらの依存関係を利用します。

沈降モデルが記述するもの

粒子運動の背後にある力のバランス

このモデルは、遠心浮力と粘性抵抗のバランスから導かれます：

[ 6\pi\mu_cRu_r

\frac{4}{3}\pi R^3G(\rho_p-\rho_f) ]

半径方向の沈降速度について解くと、以下のようになります。

[ u_r= \frac{2R^2G(\rho_p-\rho_f)}{9\mu_c} ]

これは、ストークスの沈降法則の遠心分離版です。遠心加速度は位置に依存します：

[ G=\omega^2r ]

したがって、粒子は一般的にローター内を外側へ移動するにつれて速く移動します。

粒子径が非常に大きな影響を与える理由

沈降速度は (R^2) に比例します。そのため、粒子半径がわずかに減少するだけで、回収に必要な力や時間が大幅に増加する可能性があります。

これが、より小さなオルガネラ、膜断片、または小胞を懸濁状態のままにして、無傷の細胞や核を沈降させることができる理由です。

密度差が重要な理由

駆動力は単なる粒子密度ではなく、(\rho_p-\rho_f) に依存します。低密度媒体中の高密度粒子は容易に沈降しますが、周囲の流体と密度が近い粒子は、より強い遠心力やより長い滞留時間を必要とする場合があります。

密度差は画分の純度にも影響を与える可能性があります。サイズが同じでも密度が異なる粒子は異なる速度で沈降する可能性がありますが、生物学的粒子はしばしば不規則で変形しやすく、組成も不均一です。

方程式が運転パラメータを決定する方法

ローター速度の選択

モデルは、沈降時間が (\omega^2) に反比例することを示しています：

[ t\propto\frac{1}{\omega^2} ]

したがって、モデルの前提が有効であり、装置がその速度で安全に運転できる限り、角速度を上げると指定された半径方向の移動に必要な時間が短縮されます。

実際には、ローター速度はRPM単独ではなく、相対遠心力（RCF）によって指定されることが一般的です。RCFは回転速度とローター半径の両方に依存するため、同じRPMでも遠心分離機によって分離力が異なる場合があります。

回転時間の選択

バッチ式遠心分離機の場合、計算された時間は粒子が (r_1) から (r_2) まで移動するために必要な概算時間です。対数的な半径項は、遠心場が位置によって変化するという事実を考慮しています。

プロセスエンジニアは、この方程式を使用して最小スピン時間を推定し、非理想的な挙動、ペレット形成、再懸濁効果、および供給物の変動に対する操作マージンを追加できます。

粘度と温度の考慮

沈降時間は粘度に正比例します：

[ t\propto\mu_c ]

粘度の高いブロスは抵抗を増加させ、粒子の移動を遅くします。温度は粘度を変化させるだけでなく、細胞の完全性、製品の安定性、およびプロセス流体の粘度にも影響を与えるため、重要なプロセス変数となります。

したがって、パイロットスケールのプロトコルでは、粘度を運転条件から独立した定数として扱うのではなく、温度を制御または記録する必要があります。

モデルと流量の関連付け

連続式遠心分離機では、沈降時間と分離ゾーン内での粒子の滞留時間を比較することが重要です。供給流量を増やすと滞留時間が短縮され、バッチ運転であれば沈降するはずの粒子が液相と共に排出される可能性があります。

その結果、モデルは遠心力と流量を関連付けます。流量を増やす場合は、回収率を維持するために、より高いRCF、より大きな有効沈降面積、より低い粘度、または異なる遠心分離機の構成が必要になる場合があります。

微分遠心分離がモデルをどのように利用するか

第1ステップ：最大の構造物を除去する

微分遠心分離は、最大または最も沈降速度の速い物質をペレット化するように設計された、比較的低い遠心力から始まります。生物学的システムによっては、この画分に無傷の細胞、細胞凝集体、および核が含まれる場合があります。

典型的な低速ステージでは約 600 g を使用することがありますが、適切な値は粒子集団、供給物の粘度、ローターの形状、および目標とする回収率によって異なります。

第2ステップ：中間の粒子を回収する

第1ステップの上澄みには、よりゆっくりと沈降する小さな構造物が含まれています。遠心力を上げることで、ミトコンドリアなどの中間サイズのオルガネラを沈降させ、より小さな物質を懸濁状態のままにすることができます。

中速ステージでは約 15,000 g を使用することがあります。この値はプロセス条件の一例であり、普遍的な仕様ではありません。

第3ステップ：微細な断片を回収する

残りの上澄みには、ミクロソーム断片、膜小胞、リボソーム、およびその他の微細な物質が含まれている可能性があります。これらの粒子は半径が小さいため沈降速度が低く、大幅に高い遠心力または長い滞留時間を必要とします。

装置、製品、およびプロセス流体がその運転範囲に対応している場合、ミクロソームの回収には 100,000 g 近い超遠心分離ステップが使用されることがあります。

分画の選択性を維持する

この順序が機能するのは、次のより強いステップを加える前に、各ステップで画分を除去するためです。数学的モデルは、小さな汚染物質を同じ画分に不必要に沈降させることなく、十分な回収率を得るための条件を選択するのに役立ちます。

目的は単に力を最大化することではありません。回収率、選択性、製品の完全性、処理時間、および装置の能力のバランスを取ることです。

実験室の方程式からパイロットプラントの運転へ

粒子と流体の入力を定義する

方程式を使用する前に、プロセスチームは以下の現実的な推定値を得る必要があります：

• 粒子半径またはサイズ分布
• 粒子密度
• 流体密度
• 流体粘度
• ローター速度
• 内側および外側の半径方向の位置
• 必要な滞留時間またはバッチ時間

供給物に凝集体、破砕細胞、または幅広いオルガネラ分布が含まれている場合、単一の公称粒子サイズを使用すると誤解を招く可能性があります。

RPMと遠心力の関連付け

モデルはラジアン毎秒の角速度を使用しますが、遠心分離の手順では通常RPMまたはRCFが指定されます。これらの量は一貫して変換する必要があります。

実用的な計算では、実際のローター半径を使用し、関連する半径方向の位置における結果のRCFを確認する必要があります。RPMのみを報告することは、ローター寸法が異なる装置を比較するには不十分です。

ローター形状を正しく使用する

項

[ \ln\left(\frac{r_2}{r_1}\right) ]

は、形状が沈降時間に影響を与えることを示しています。より大きな半径方向の区間を移動する粒子は一定の遠心力を受けないため、分離ゾーンの内側と外側の位置が重要になります。

パイロットスケールの装置において、実験用遠心分離機からのRPMと時間の直接的な転用が不十分な結果をもたらす可能性があるのは、このためです。ローターの寸法と流路も考慮に入れる必要があります。

モデルをスケールアップに適用する

バッチ式微分遠心分離の場合、関連する遠心条件と沈降経路を一致させることが有用な出発点となります。連続式遠心分離機の場合、スケールアップではさらに、供給速度、滞留時間分布、固形分負荷、有効沈降面積、および粒子間相互作用を考慮する必要があります。

ストークス方程式は物理的基礎を提供しますが、信頼性の高いパイロットプラントの運転範囲を確立するには、装置固有の性能データが必要です。

トレードオフを理解する

高い遠心力が常に優れているとは限らない

RCFを上げると計算上の沈降時間は短縮されますが、エネルギー需要、機械的ストレス、ペレットの圧縮、および繊細な生物学的構造を損傷するリスクが増加する可能性もあります。

固く圧縮されたペレットは再懸濁が困難な場合があり、見かけ上の沈降性能が向上しても製品回収率が低下することがあります。

理想粒子という仮定には限界がある

この方程式は、明確に定義された密度と半径を持ち、層流かつ低レイノルズ数条件下で移動する球形粒子を想定しています。生物学的粒子は不規則、柔軟、多孔質、変形可能、または互いに結合している場合があります。

高濃度では、妨害沈降や混雑により、孤立粒子予測と比較して実際の分離速度が低下する可能性があります。

密度と粘度は処理中に変化する可能性がある

細胞溶解により、ブロスの粘度や粒子の相互作用を変化させるポリマー、タンパク質、核酸、膜物質が放出される可能性があります。バッファー交換、希釈、温度変化、および濃縮ステップも流体特性を変化させる可能性があります。

したがって、ホモジナイズ前に測定されたパラメータは、遠心分離中の条件を代表していない可能性があります。

ホモジナイズは分離ターゲットに影響する

遠心分離は、上流の破砕によって生成された粒子集団しか分離できません。過度のホモジナイズはオルガネラを断片化して物質をより小さな画分に移行させる可能性があり、不十分な破砕は製品を無傷の細胞内に残したままにする可能性があります。

したがって、機械的せん断と超音波キャビテーションは、放出効率と構造保存の両方を念頭に置いて選択する必要があります。

清澄化と製品回収には異なる装置が必要な場合がある

沈降遠心分離機は、主な目的が清澄化された液体の回収や、密度と沈降挙動に基づく分離である場合に適しています。ろ過遠心分離機は、より大きな固形物を保持し、固形ケーキを生成することが目的である場合に適しています。

選択は、遠心分離機の利用可能性だけでなく、ターゲットとなる相と粒子の特性に従うべきです。

目標に適した選択をする

モデルは設計計算として使用し、その後、回収率、純度、清澄化、および製品の完全性のパイロットスケール測定で検証する必要があります。

• 主な焦点が無傷の細胞または核の除去である場合： これらの粒子の大きな半径を利用しつつ、小さな物質の不必要なペレット化を最小限に抑える、低遠心力で滞留時間の長いステップを使用してください。
• 主な焦点がオルガネラの分画である場合： 公称RCF値のみに頼るのではなく、段階的に遠心力を上げ、各ペレットと上澄みの組成を測定してください。
• 主な焦点が連続パイロットプラントのスループットである場合： 計算された沈降時間と実際の滞留時間を比較し、供給速度、ローター速度、粘度、および有効沈降面積を調整してください。
• 主な焦点がプロセスのスケールアップである場合： 関連する粒子と流体の特性を維持しながら、新しいローター形状に合わせて条件を再計算し、実験的に性能を検証してください。
• 主な焦点が巨大分子または膜断片の回収である場合： 製品の安定性、ペレットの挙動、および希薄粒子モデルの限界を確認した後にのみ、より高い遠心力領域を使用してください。

健全な沈降モデルは、遠心分離を試行錯誤の操作から、測定可能なプロセス設計の問題へと変えます。

要約表：

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